臨門一腳，先講核心，掌握核心，引物設計任你馳騁。

引物長度

引物長度對反應特異性、解鏈溫度、退火時間都有較大的影響，最終影響到 PCR 反應 是否成功。多數情況下，引物長度約 18~30bp, 引物太短會導致非特異擴增，太長雖然會增加特異性，但是二級結構（如發夾結構）出現的概率增大。

引物的解鏈溫度

PCR 反應的特異性很大程度上依賴于引物的解鏈溫度（Tm 值）。多數 PCR 反應的 解鏈溫度應在 55~60℃，如果沒有其他不穩定因素，引物的 Tm 值取決于它的長度、序列組成和濃度，離子強度的影響可以忽略不計，因為不同的 PCR 反應鹽濃度變化不大。

一個反應中所有引物的解鏈溫度應盡可能接近。對于多數 PCR 反應而言，引物之間的 差應小于 2~3℃。差值增大，反應效率會降低，甚至直接導致反應失敗。因為 Tm 值髙 的引物在低于退火溫度的條件下錯配，而 Tm 值低的引物在髙于退火溫度的條件下與模板只 有低濃度結合。

可利用以最近鄰熱力學理論為基礎的公式估算 Tm 值，該理論分析了復式解鏈的熱力學過程。

Tm = [△H/△S-RIn(c)]-273.15（公式 1）

復式構成物中焓變（△H）和熵變（△S ）可借助于最近鄰熱力學參數計算，為摩爾氣 體常數，c 為寡核苷酸的物質的量濃度。該分析可確定特定的焓和熵對復式構成物的自由能 的影響，該影響由序列中的「最近鄰」造成。最近鄰從 5' 末端起始，焓和熵的效應是加性的。在式（1）中加人另一個條件，以經驗性地計算鹽對復式構成物的穩定性的影響。

Tm =[△H/△ S + R In(c)] - 273.15 + 12.0lg[Na+] （公式 2）

大多數引物設計軟件都使用 Breslaner 或 SntaLucia 最近鄰參數系統估算寡核苷酸復式構成物的 Tm 值（Breslauer et al. 1986; SantaLucia 1998)。

對于由 20 個或更少個堿基組成的短序列，可用 Wallace 原理計算其位近似值。該 公式假定鹽的濃度為 0.9 mol/L，這是斑點雜交分析的常用濃度。

Tm = 2℃ * (A + T) + 4℃ * (G + C) （公式 3）

一般來說，退火溫度比引物解鏈溫度低 5°C。但是，根據這一原則得出的退火溫度常常 并不是的，必須通過實驗獲得溫度。利用梯度熱循環儀很容易實現這一目的。另外，可利用更精確的公式計算乃值（退火溫度）（Rychliketal.1990)。

Ta = 0.3 * 引物 Tm 值 + 0.7 * 產物 Tm 值 - 25 （公式 4）

復制子的解鏈溫度

除了計算引物的解鏈溫度以外，還要保證產物的解鏈溫度要足夠低，以保證其在 92℃ 時完全解鏈。一般來說，100~600bp 的片段可以有效擴增。該參數有助于使 PCR 效率更高，但并不總是成功的 PCR 所必需的。產物的 Tm 值可根據（式 5） 計算。

Tm = 81. 5 + 16. 6*(lg10[K+])+0.41(%G+C) - 675/長度 （公式 5）

二級結構

設計引物時，另一個需要考慮的重要因素是二級結構的存在。一個帶有自身同源序列的引物可以回折形成部分雙鏈的發夾結構。類似地，引物之間的同源可能引起引物二聚體的形 成。PCR 反應時，相對于模板而言，引物濃度髙很多，引物之間相互退火要比引物與模板 之間退火容易得多。因此，引物如果存在發夾結構或者二聚體，對于 PCR 擴增往往 是致命的，因為這樣會導致非特異的大量背景產物的擴增。避免出現二級結構的最簡單的方 法是：選擇 GC 含量約 50%、四種堿基中缺少一種的引物。

重復

同一堿基或幾個核苷酸的重復也應盡量避免。不同的重復對 PCR 反應的影響見表 1。

GC 夾

在引物的 3'端包含一個 G 或 C 殘基可增加引物擴增效率，這就是所謂的「GC 夾」。它 可以促進引物的 3'端正確地結合到模板，因為 GC 夾可以形成更為穩定的氫鍵，因此可以提髙擴增的特異性。以胸腺嘧啶結尾的引物的特異性有降低的趨勢。

高 GC 含量片段的擴增

為了擴增高 GC 含量的 DNA，應該設計 Tm 值（為 75~80℃) 較高的引物。髙 GC 含量的 DNA 雙鏈完全解開所需的溫度明顯較一般的 DNA 高。溫度較低時，PCR 復制子的兩條單鏈有較快地重新退火的趨勢，可與引物退火相互競爭。因此，PCR 過程中退火溫度較髙有助于引物退火，因此可以提髙擴增效率。

非目標同源

應利用 BLAST程序對引物序列進行檢索，查詢是否有競爭性序列與其交叉同源或基因組中是否有別的位點與其同源，這種同源序 列將導致引物錯配和產生非特異的擴增產物。