鎳-NTA瓊脂糖凝膠6FF
作者：技術 來源：北京瑞達恒輝科技發展有限公司 2024-11-07 瀏覽量：92
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不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據相關的文獻進行。
1 簡介
金屬螯合親和層析介質，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+發生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質，從而達到分離純化的目的。因此，偶聯這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。一般來說，Ni2+是用于純化組氨酸標記的蛋白質的優選金屬離子。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結合，但這種結合力要遠小于組氨酸殘基與金屬離子的結合力。
鎳親和層析介質具有特異性好、流速快的優點，非常適合放大生產。
2 性能參數：
*檢測條件： 層析柱16mm×200mm *柱床高5cm，25℃
3 使用方法
Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預先偶聯Ni2+離子。通常，Ni2+是用于純化重組組氨酸標簽蛋白的優選金屬離子，用咪唑進行洗脫。
我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液，中性至弱堿性pH 7-8，這樣的條件下結合，經常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl，但是在金屬-蛋白質親和力非常弱的情況下應該避免，因為它可以降低結合強度，在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。
如果重組組氨酸標簽蛋白表達為包涵體，則在所有緩沖液中包括高達6M Gua-HCl或8M尿素。當使用高濃度的尿素或Gua-HCl時，通常發生蛋白質解折疊。包涵體變性復性是個很復雜的過程，一般的建議純化可溶蛋白。
提示：含有尿素的樣品可以通過SDS-PAGE直接分析，而含有Gua-HCl的樣品在SDS-PAGE之前必須用尿素緩沖液置換緩沖液。
3.1 緩沖液制備
用于緩沖液制備的水和化學品應具有高純度。使用前通過0.45μm過濾器過濾緩沖液。 使用高純度咪唑，因為這將在280nm處產生非常低的吸光度或沒有吸光度。
推薦緩沖液
結合緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，pH 7.4（最佳咪唑濃度是依蛋白質性質而定的，20-40mM適用于許多蛋白質）。
洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4（洗脫所需的咪唑濃度是依蛋白質性質而定的）。
3.2裝柱
（1）讓所有的材料和試劑達到室溫。配制初始緩沖液（平衡液）和洗脫緩沖液。
（2）根據柱子大小取所需量的凝膠，用去離子水清洗掉20%乙醇，用初始緩沖液（按凝膠：緩沖液=3：1的比例）配成勻漿。
（3）將柱內及柱子底端用水或緩沖液潤濕并保持一小段液位，務必使底端無氣泡。
（4）用玻璃棒引導勻漿沿著柱內壁一次性倒入柱內，注意勿使產生氣泡。打開柱子出液口，使凝膠在柱內自由沉降，連結好柱子頂端柱頭。
（5）打開蠕動泵，讓緩沖液用使用時流速的1.33倍的流速流過，使柱床穩定（注意壓力不要超過填料最大耐壓）。
3.3 樣品的制備
樣品應完全溶解。為了避免堵塞層析柱，我們建議通過0.45μm過濾器進行離心和過濾，以去除細胞碎片或其他顆粒物質。
3.4 平衡色譜柱
用5-10個柱體積的結合緩沖液平衡該柱，直到流出液電導和pH不變。
3.5 上樣
（1）樣品用平衡液配制，樣品一定要離心或過濾后上樣。鹽濃度太大的樣品需要處理后再配。
（2）一般情況是讓目標產品結合在柱子上，用平衡液洗去雜質和沒有結合的蛋白，再選擇一種洗脫液洗下目標產品。
3.6 洗脫
用洗脫緩沖液使用階梯梯度或線性梯度洗脫。對于洗脫步驟，5個柱體積的洗脫緩沖液通常就足夠了。對于線性梯度洗脫，適當增加洗脫步驟。
注意：當手動測量吸光度時，使用洗脫緩沖液作為空白。 如果需要從蛋白質中去除咪唑，使用脫鹽柱或透析手段。
3.7 手動操作
1) 輕輕搖動裝有Ni-瓊脂糖凝膠6FF的瓶子，直到介質均勻。
2) 從瓶中取出2ml漿液，并轉移到離心管中。
3) 3.500×g離心5分鐘沉淀Ni-瓊脂糖凝膠6FF。
4) 棄去上清液，并換成5ml蒸餾水。
5) 輕輕搖動Ni-瓊脂糖凝膠6FF，3分鐘，并通過在500×g離心5分鐘來分離。
6) 使用結合緩沖液代替蒸餾水重復步驟4和5，至少3-5次。
7) 將Ni-瓊脂糖凝膠6FF轉移到量筒。
8) 加入適當體積的結合緩沖液以制備50％漿液。
9) 將4ml樣品加入1ml 50％漿液中。Ni-瓊脂糖凝膠6FF的結合能力是依據蛋白質的性質不同而不同的，平均值為20-40mg/ml。這意味著1ml的50％漿液可以結合大約10-20mg組氨酸標記的蛋白質。
10) 將樣品和Ni-瓊脂糖凝膠6FF漿液在室溫下在搖床上低速孵育1小時。
11) 用2×1ml結合緩沖液洗滌并收集兩種組分。
12) 用4×0.5ml洗脫緩沖液洗脫，并將洗脫的組分收集在四個單獨的管中。
13) 使用分光光度計測量280nm處的吸光度，并通過SDS-PAGE確認各組分的純度。使用洗脫緩沖液作為空白。
4. 可能的問題
4.1 柱子堵塞
（1）樣品中的細胞碎片可能堵塞色譜柱。
（2）通過0.22μm或0.45μm過濾器離心和/或過濾樣品。
4.2 洗脫液中沒有發現組氨酸標簽蛋白
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質仍然結合）：用增加咪唑的濃度或降低pH洗脫以確定最佳洗脫條件。
（2）樣品或結合緩沖液中咪唑的濃度太高，影響了his蛋白質的結合，這時，需要降低樣品或結合緩沖液中咪唑濃度。
（3）靶蛋白可能不是預期的組氨酸標簽蛋白：驗證DNA序列。
（4）組氨酸標簽可能未充分暴露，所以沒有結合到填料上。
（5）對于包涵體，在蛋白質的變形復性過程中，活性喪失。盡量選擇可溶性蛋白進行純化。
（6）緩沖液或樣品組成不正確：檢查樣品和結合緩沖液的pH和組成，確保溶液中螯合劑或強還原劑以及咪唑的濃度不要太高。
4.3 洗脫的蛋白質不純
如果雜蛋白對鎳離子同樣具有高親和力，這時需要優化結合緩沖液的咪唑濃度，如果優化條件除不去雜蛋白，可能需要通過離子交換層析或凝膠過濾進一步純化。
5 再生
注意：如果要純化相同的蛋白質，則不必在每次純化之間去再生，在5-7次純化后再生就足夠了。
為了重新對Ni-瓊脂糖凝膠6FF掛Ni2+，首先除去殘留的Ni2+：
（1）用20mM磷酸緩沖液，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH 7.4，沖洗柱子，洗5個柱體積，以洗去殘留的Ni2+離子；
（2）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗掉殘留的EDTA；
（3）用0.1M NiSO4過柱子，2-5個柱體積；
（4）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗沒有結合的Ni2+離子；
（5）用20%的乙醇過柱子，讓填料保存在20%的乙醇環境中。
6 在位清洗（CIP）
（1）當看到背壓增加時，就應該清洗色譜柱，對柱子重新掛鎳再生。
（2）除去離子交換作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床體積2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗，最后用水徹底清洗。
7 保存
使用完的填料，用純水徹底沖洗，最后保存在20%乙醇中，4℃保存。
注意事項：
1.上樣之前，樣品必須經過膜過濾及去除色素，否則雜質及色素會被吸附到填料上，影響填料的正常使用。
2.在使用過程中，避免使用高濃度的強酸強堿，酸和堿的濃度應低于0.1摩爾。堿會使流速變慢。
3.不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據相關的文獻進行。
金屬螯合親和層析介質，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+發生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質，從而達到分離純化的目的。因此，偶聯這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個組氨酸的蛋白以及對金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。一般來說，Ni2+是用于純化組氨酸標記的蛋白質的優選金屬離子。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結合，但這種結合力要遠小于組氨酸殘基與金屬離子的結合力。
鎳親和層析介質具有特異性好、流速快的優點，非常適合放大生產。
2 性能參數：
| 基質 | 6%的交聯瓊脂糖凝膠 |
| 配體 | Ni2+ |
| 配體密度 | 10-15μmol /ml |
| 吸附載量 | 20-40mg his標簽蛋白/ml填料 |
| 介質顆粒大小 | 45-165μm |
| 最大流速 | 300cm/h |
| pH范圍 | 3-10，在位清洗時pH范圍可到2-11 |
| 化學穩定性 | 0.01 M HCl，0.1 M NaOH |
| 保存溫度 | +4-8℃ |
| 保存液體 | 20%乙醇 |
3 使用方法
Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預先偶聯Ni2+離子。通常，Ni2+是用于純化重組組氨酸標簽蛋白的優選金屬離子，用咪唑進行洗脫。
我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液，中性至弱堿性pH 7-8，這樣的條件下結合，經常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl，但是在金屬-蛋白質親和力非常弱的情況下應該避免，因為它可以降低結合強度，在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。
如果重組組氨酸標簽蛋白表達為包涵體，則在所有緩沖液中包括高達6M Gua-HCl或8M尿素。當使用高濃度的尿素或Gua-HCl時，通常發生蛋白質解折疊。包涵體變性復性是個很復雜的過程，一般的建議純化可溶蛋白。
提示：含有尿素的樣品可以通過SDS-PAGE直接分析，而含有Gua-HCl的樣品在SDS-PAGE之前必須用尿素緩沖液置換緩沖液。
3.1 緩沖液制備
用于緩沖液制備的水和化學品應具有高純度。使用前通過0.45μm過濾器過濾緩沖液。 使用高純度咪唑，因為這將在280nm處產生非常低的吸光度或沒有吸光度。
推薦緩沖液
結合緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，pH 7.4（最佳咪唑濃度是依蛋白質性質而定的，20-40mM適用于許多蛋白質）。
洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4（洗脫所需的咪唑濃度是依蛋白質性質而定的）。
3.2裝柱
（1）讓所有的材料和試劑達到室溫。配制初始緩沖液（平衡液）和洗脫緩沖液。
（2）根據柱子大小取所需量的凝膠，用去離子水清洗掉20%乙醇，用初始緩沖液（按凝膠：緩沖液=3：1的比例）配成勻漿。
（3）將柱內及柱子底端用水或緩沖液潤濕并保持一小段液位，務必使底端無氣泡。
（4）用玻璃棒引導勻漿沿著柱內壁一次性倒入柱內，注意勿使產生氣泡。打開柱子出液口，使凝膠在柱內自由沉降，連結好柱子頂端柱頭。
（5）打開蠕動泵，讓緩沖液用使用時流速的1.33倍的流速流過，使柱床穩定（注意壓力不要超過填料最大耐壓）。
3.3 樣品的制備
樣品應完全溶解。為了避免堵塞層析柱，我們建議通過0.45μm過濾器進行離心和過濾，以去除細胞碎片或其他顆粒物質。
3.4 平衡色譜柱
用5-10個柱體積的結合緩沖液平衡該柱，直到流出液電導和pH不變。
3.5 上樣
（1）樣品用平衡液配制，樣品一定要離心或過濾后上樣。鹽濃度太大的樣品需要處理后再配。
（2）一般情況是讓目標產品結合在柱子上，用平衡液洗去雜質和沒有結合的蛋白，再選擇一種洗脫液洗下目標產品。
3.6 洗脫
用洗脫緩沖液使用階梯梯度或線性梯度洗脫。對于洗脫步驟，5個柱體積的洗脫緩沖液通常就足夠了。對于線性梯度洗脫，適當增加洗脫步驟。
注意：當手動測量吸光度時，使用洗脫緩沖液作為空白。 如果需要從蛋白質中去除咪唑，使用脫鹽柱或透析手段。
3.7 手動操作
1) 輕輕搖動裝有Ni-瓊脂糖凝膠6FF的瓶子，直到介質均勻。
2) 從瓶中取出2ml漿液，并轉移到離心管中。
3) 3.500×g離心5分鐘沉淀Ni-瓊脂糖凝膠6FF。
4) 棄去上清液，并換成5ml蒸餾水。
5) 輕輕搖動Ni-瓊脂糖凝膠6FF，3分鐘，并通過在500×g離心5分鐘來分離。
6) 使用結合緩沖液代替蒸餾水重復步驟4和5，至少3-5次。
7) 將Ni-瓊脂糖凝膠6FF轉移到量筒。
8) 加入適當體積的結合緩沖液以制備50％漿液。
9) 將4ml樣品加入1ml 50％漿液中。Ni-瓊脂糖凝膠6FF的結合能力是依據蛋白質的性質不同而不同的，平均值為20-40mg/ml。這意味著1ml的50％漿液可以結合大約10-20mg組氨酸標記的蛋白質。
10) 將樣品和Ni-瓊脂糖凝膠6FF漿液在室溫下在搖床上低速孵育1小時。
11) 用2×1ml結合緩沖液洗滌并收集兩種組分。
12) 用4×0.5ml洗脫緩沖液洗脫，并將洗脫的組分收集在四個單獨的管中。
13) 使用分光光度計測量280nm處的吸光度，并通過SDS-PAGE確認各組分的純度。使用洗脫緩沖液作為空白。
4. 可能的問題
4.1 柱子堵塞
（1）樣品中的細胞碎片可能堵塞色譜柱。
（2）通過0.22μm或0.45μm過濾器離心和/或過濾樣品。
4.2 洗脫液中沒有發現組氨酸標簽蛋白
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標記的蛋白質仍然結合）：用增加咪唑的濃度或降低pH洗脫以確定最佳洗脫條件。
（2）樣品或結合緩沖液中咪唑的濃度太高，影響了his蛋白質的結合，這時，需要降低樣品或結合緩沖液中咪唑濃度。
（3）靶蛋白可能不是預期的組氨酸標簽蛋白：驗證DNA序列。
（4）組氨酸標簽可能未充分暴露，所以沒有結合到填料上。
（5）對于包涵體，在蛋白質的變形復性過程中，活性喪失。盡量選擇可溶性蛋白進行純化。
（6）緩沖液或樣品組成不正確：檢查樣品和結合緩沖液的pH和組成，確保溶液中螯合劑或強還原劑以及咪唑的濃度不要太高。
4.3 洗脫的蛋白質不純
如果雜蛋白對鎳離子同樣具有高親和力，這時需要優化結合緩沖液的咪唑濃度，如果優化條件除不去雜蛋白，可能需要通過離子交換層析或凝膠過濾進一步純化。
5 再生
注意：如果要純化相同的蛋白質，則不必在每次純化之間去再生，在5-7次純化后再生就足夠了。
為了重新對Ni-瓊脂糖凝膠6FF掛Ni2+，首先除去殘留的Ni2+：
（1）用20mM磷酸緩沖液，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH 7.4，沖洗柱子，洗5個柱體積，以洗去殘留的Ni2+離子；
（2）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗掉殘留的EDTA；
（3）用0.1M NiSO4過柱子，2-5個柱體積；
（4）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗沒有結合的Ni2+離子；
（5）用20%的乙醇過柱子，讓填料保存在20%的乙醇環境中。
6 在位清洗（CIP）
（1）當看到背壓增加時，就應該清洗色譜柱，對柱子重新掛鎳再生。
（2）除去離子交換作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床體積2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗，最后用水徹底清洗。
7 保存
使用完的填料，用純水徹底沖洗，最后保存在20%乙醇中，4℃保存。
注意事項：
1.上樣之前，樣品必須經過膜過濾及去除色素，否則雜質及色素會被吸附到填料上，影響填料的正常使用。
2.在使用過程中，避免使用高濃度的強酸強堿，酸和堿的濃度應低于0.1摩爾。堿會使流速變慢。
3.不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據相關的文獻進行。
