單細(xì)胞技術(shù)不僅在測序方面取得了極大進(jìn)展，單細(xì)胞質(zhì)譜分析也正在逐漸得到更多的關(guān)注。與用于分析單個(gè)細(xì)胞基因組的單細(xì)胞測序不同，單細(xì)胞質(zhì)譜主要是研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的代謝物情況。
  今年初，中國科大的熊偉教授和黃光明教授等人在PNAS上發(fā)表了一項(xiàng)研究，他們利用一種新技術(shù)對單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的數(shù)千種化學(xué)小分子進(jìn)行了快速質(zhì)譜檢測，并且可以做到同步采集電生理信號，在單細(xì)胞層次上成功地完成了對神經(jīng)元功能、代謝物組成及其代謝通路的研究。
 采訪嘉賓：熊偉 (中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師)
  世界上沒有兩片完全相同的葉子，細(xì)胞也是。然而，科學(xué)家們在進(jìn)行現(xiàn)代生物學(xué)研究時(shí)，大多時(shí)候都考察的是細(xì)胞群體，而忽略了細(xì)胞異質(zhì)性。
  就拿神經(jīng)細(xì)胞來說，大腦中有億萬個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，這些神經(jīng)細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)，突觸連結(jié)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，電生理以及生理功能上具有高度的多樣性。不同種類的神經(jīng)細(xì)胞中，其基因組、蛋白組、化學(xué)分子組成、含量、代謝也都有著很大的差別。在直徑不到1毫米的一個(gè)很小的腦區(qū)，可能就存在幾十種甚至上百種完全不同的神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞類型。甚至很多情況下，即使物理距離上相鄰的兩個(gè)神經(jīng)元也可能是兩個(gè)不同的神經(jīng)元類型。因此，對腦內(nèi)單個(gè)神經(jīng)元的基因組、蛋白質(zhì)組以及代謝組進(jìn)行分析，具有重要的生物學(xué)價(jià)值。
  單細(xì)胞技術(shù)在近年發(fā)展非常迅速，比如單細(xì)胞測序，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生命學(xué)科的研究。2014年1月Nature Methods上發(fā)表的年度特別報(bào)道，將“單細(xì)胞測序”(Singled out for sequencing)的應(yīng)用列為2013年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展。
  單細(xì)胞技術(shù)不僅在測序方面取得了極大進(jìn)展，單細(xì)胞質(zhì)譜分析也正在逐漸得到更多的關(guān)注。與用于分析單個(gè)細(xì)胞基因組的單細(xì)胞測序不同，單細(xì)胞質(zhì)譜主要是研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的代謝物情況，例如化學(xué)小分子的組成、含量和代謝等等。單細(xì)胞質(zhì)譜的優(yōu)勢在于可以高通量檢測目前其它單細(xì)胞技術(shù)無法檢測的小分子化合物，以及它們的代謝過程。同時(shí)，由于質(zhì)譜本身的優(yōu)勢，不需要采取測序或者特異性抗體等外部手段，就可以精確分析檢測到的化學(xué)物質(zhì)信息，可以說是“物美價(jià)廉”。 不過，由于質(zhì)譜技術(shù)本身的局限性，目前還無法做到類似單細(xì)胞測序那樣的大規(guī)模測量。
  多學(xué)科交叉合作，開發(fā)單神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)譜
  2013年，熊偉教授結(jié)束了在美國國立衛(wèi)生研究院的博士后研究工作，回國后加入了中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。在申請中組部“青年千人計(jì)劃”時(shí)，熊偉教授認(rèn)識了另一位中科大化學(xué)學(xué)院的“青千”黃光明教授，當(dāng)時(shí)，黃光明教授課題組正在發(fā)展一種小樣品(pL級別)質(zhì)譜測量技術(shù)。經(jīng)過多次討論，他們決定將兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)勢技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，開發(fā)單神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)譜這一新技術(shù)。
  目前質(zhì)譜技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用，主要還是采用對大量組織細(xì)胞勻漿后的樣品進(jìn)行分析。在單細(xì)胞檢測中，質(zhì)譜分析因?yàn)榫哂懈哽`敏度，大的線性范圍以及高通量分析化學(xué)分子的特點(diǎn)，逐漸被用于單細(xì)胞的細(xì)胞代謝分析。但目前的方法需要使用大量有機(jī)試劑對細(xì)胞進(jìn)行處理，無法保持采樣時(shí)細(xì)胞的活性；冗長的處理和分離過程也導(dǎo)致較慢的分析速度，無法短時(shí)間內(nèi)完成大量單細(xì)胞分析；并缺乏來自同一細(xì)胞的電生理信號；最終導(dǎo)致單細(xì)胞代謝物的質(zhì)譜分析無法大規(guī)模用于神經(jīng)細(xì)胞的分析。
  新技術(shù)讓質(zhì)譜分析活體單個(gè)神經(jīng)元成為現(xiàn)實(shí)
  2017年1月26日，熊偉教授與黃光明教授等人在PNAS上發(fā)表了一項(xiàng)題為“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在這項(xiàng)新研究中，研究團(tuán)隊(duì)依托電生理膜片鉗以及電噴霧離子源技術(shù)建立了一種穩(wěn)定的單神經(jīng)元胞內(nèi)組分取樣和質(zhì)譜組分分析技術(shù)。
  膜片鉗與單細(xì)胞質(zhì)譜分析聯(lián)用技術(shù)分析單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞示意圖
  電生理膜片鉗能將玻璃微電極接觸并吸附在細(xì)胞膜上，高阻抗封接后將膜打穿成孔，記錄膜片以外部位的全細(xì)胞膜的離子電流。而電噴霧技術(shù)主要是利用一個(gè)高壓交流電使分析物被離子化然后被質(zhì)譜檢測，該離子源具有較強(qiáng)的抗干擾能力。與傳統(tǒng)的質(zhì)譜方法相比，這一新方法最大的優(yōu)勢是可以原位對活細(xì)胞進(jìn)行取樣，并且同時(shí)采集細(xì)胞位置、電生理活動以及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分等多方面的信息。
  質(zhì)譜分析讓神經(jīng)化學(xué)研究進(jìn)入單細(xì)胞水平
  研究人員利用這一方法對小鼠海馬、前額葉、杏仁核、紋狀體等腦區(qū)單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的數(shù)千種化學(xué)小分子進(jìn)行了快速質(zhì)譜檢測，并同步采集了電生理信號。
  海馬、前額葉、杏仁核、紋狀體這四個(gè)核團(tuán)無論是在人類還是低等動物中都非常重要，與學(xué)習(xí)、記憶和情緒等行為以及相關(guān)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等有著密切的聯(lián)系。這些核團(tuán)內(nèi)的神經(jīng)元種類繁多，目前國內(nèi)外有多個(gè)課題組正在從單細(xì)胞測序的角度解析這些核團(tuán)的神經(jīng)元分類及對其功能進(jìn)行鑒定。熊偉教授表示，他們對這四個(gè)核團(tuán)神經(jīng)元進(jìn)行質(zhì)譜研究，也正是想從單細(xì)胞水平全面分析這些核團(tuán)神經(jīng)元的代謝組學(xué)情況，以及這些代謝通路和代謝組在學(xué)習(xí)、記憶和情緒等行為及其相關(guān)疾病中的作用機(jī)制。
   在這項(xiàng)研究中，研究人員主要對不同年齡段的小鼠海馬、杏仁核、紋狀體等腦區(qū)單個(gè)神經(jīng)元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化學(xué)小分子進(jìn)行定性、定量分析并對其進(jìn)行神經(jīng)元分類。
   Glu和GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)兩大類神經(jīng)遞質(zhì)(興奮性或抑制性)的代表性分子。早期人們認(rèn)為一個(gè)神經(jīng)元內(nèi)只存在一種遞質(zhì)，其全部末梢只能釋放同一種遞質(zhì)，這被稱之為戴爾原則(Dales principle)。然而隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到兩種或兩種以上遞質(zhì)(包括調(diào)質(zhì))可存在于同一神經(jīng)元內(nèi)，在適當(dāng)?shù)拇碳は驴山?jīng)突觸前膜共同釋放。這種新的觀點(diǎn)得到了眾多電生理及免疫組化等實(shí)驗(yàn)的證明。然而這些證據(jù)大部分都是間接的證據(jù)，尚無直接證據(jù)表明二者的共存。這項(xiàng)研究首次在單細(xì)胞水平，通過質(zhì)譜分析給出了二者共存于同一神經(jīng)元內(nèi)的直接證據(jù)。同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些尚未在神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)的小分子，他們正在努力研究其作用和分子機(jī)制。
  此外，研究還鑒定了單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)谷氨酰胺的代謝路徑。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代謝的經(jīng)典通路，尤其是谷氨酸，它不僅僅作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)存在于神經(jīng)元內(nèi)，還大量參與到蛋白質(zhì)的合成代謝以及細(xì)胞能量供應(yīng)體系中。而GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性遞質(zhì)，可以防止神經(jīng)細(xì)胞過度興奮。二者與各種腦疾病都有著密切的關(guān)系，如自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病等。該通路在大腦的發(fā)育和衰老中扮演著非常重要的角色。對單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)谷氨酰胺的代謝路徑的鑒定對于深入理解這條代謝通路以及與之相關(guān)的疾病機(jī)制具有重要意義。
 　　這項(xiàng)研究首次利用化學(xué)質(zhì)譜方法直接無稀釋地檢測單個(gè)神經(jīng)元中多種神經(jīng)遞質(zhì)、代謝物、脂質(zhì)等化學(xué)小分子，對單個(gè)神經(jīng)元化學(xué)成分及代謝物進(jìn)行了即時(shí)分析，并將目前神經(jīng)細(xì)胞成分分析的研究推向了一個(gè)活細(xì)胞及單細(xì)胞水平。這一技術(shù)在將來或許能夠幫助科學(xué)家們在單細(xì)胞層次上去研究神經(jīng)生物學(xué)、代謝組學(xué)、毒理學(xué)等生命科學(xué)的重大問題。
   談到臨床應(yīng)用前景時(shí)，熊偉教授的態(tài)度也十分肯定。他表示，該技術(shù)允許研究人員對血液、腦脊液等樣品中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)合相應(yīng)的生物標(biāo)記物，完全有可能對阿爾茨海默病、帕金森病、抑郁癥等神經(jīng)精神疾病的早期診斷提供幫助。
  后記
  熊偉教授從事神經(jīng)科學(xué)研究，他認(rèn)為現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究需要技術(shù)的快速研發(fā)以及多領(lǐng)域多學(xué)科的交叉合作，必須發(fā)展包括顯微成像、分子示蹤、質(zhì)譜分析、光遺傳學(xué)以及轉(zhuǎn)基因操作等最新的生物、物理、化學(xué)與工程材料等多學(xué)科交叉技術(shù)。熊偉教授表示，對他而言，科研不僅僅是工作，也是興趣，尤其是對新技術(shù)的熱切追求，驅(qū)動著他不斷前行。熊偉教授及其研究團(tuán)隊(duì)也正在和中國科大的其它實(shí)驗(yàn)室展開合作，和不同的領(lǐng)域的科學(xué)家交流和分享科研心得是一種享受。
  關(guān)于研究人員
   該項(xiàng)工作由中科大生命學(xué)院博士后朱洪影、生命學(xué)院博士研究生鄒桂昌、王寧在熊偉教授和黃光明教授的共同指導(dǎo)下完成。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金委重大研究計(jì)劃、科技部、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(B類)以及國家青年千人計(jì)劃等的資助。該工作還得到中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)同步輻射實(shí)驗(yàn)室光電離質(zhì)譜線站的儀器與技術(shù)支持。
  關(guān)于熊偉教授
  熊偉 教授
   國家中組部“青年千人計(jì)劃”獲得者，2001年畢業(yè)于北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，獲理學(xué)學(xué)士學(xué)位。2006年畢業(yè)于北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，獲理學(xué)博士學(xué)位。2006至2013年，在美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)酒精濫用與酒精中毒研究所(NIAAA)做博士后研究工作。2013年3月加入中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。中科院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心骨干成員。中科大神經(jīng)退行性疾病研究中心暨腦資源庫核心成員。長期從事與神經(jīng)化學(xué)、藥理學(xué)、小分子藥物研發(fā)相關(guān)的神經(jīng)科學(xué)研究，運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)從分子、細(xì)胞水平、到動物行為進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，并取得了系列重要成果。研究工作發(fā)表在Nature Neuroscience, Nature Chemical Biology, Journal of Experimental Medicine, PNAS, Journal of Neuroscience, Molecular Pharmacology等國際學(xué)術(shù)期刊上。獲得過多項(xiàng)國家級基金資助。
  編輯點(diǎn)評
  質(zhì)譜分析因?yàn)榫哂懈哽`敏度，大的線性范圍以及高通量分析化學(xué)分子的特點(diǎn)，逐漸被用于單細(xì)胞的細(xì)胞代謝分析。近期，研究團(tuán)隊(duì)依托電生理膜片鉗以及電噴霧離子源技術(shù)建立了一種穩(wěn)定的單神經(jīng)元胞內(nèi)組分取樣和質(zhì)譜組分分析技術(shù)。這項(xiàng)研究首次在單細(xì)胞水平，通過質(zhì)譜分析給出了二者共存于同一神經(jīng)元內(nèi)的直接證據(jù)。